具有协同作用的防腐剂联合使用，可提高防腐剂的抗菌活性，降低单一防腐剂的使用量。为了降低抗菌肽在食品中的使用量，该课题组对多种天然防腐剂进行了筛选，发现柠檬酸与brevilaterin联用对大肠杆菌（Escherichiacoli）具有协同抑菌效应，联合使用可增强其抑菌活性。柠檬酸在食品中主要作为酸味调节剂使用，但是研究也发现其可以作为协同抑菌剂来提高Nisin的抑菌活性。

河北科技大学生物科学与工程学院的宁亚维、苏丹和北京工商大学食品与健康学院的贾英民*等人以食源性致病菌大肠杆菌为指示菌，通过时间-杀菌曲线考察了brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌的协同抑菌效应，从细胞膜损伤（如跨膜电势、膜完整性、菌体超微结构），菌体蛋白质合成以及对细菌DNA的影响三方面研究了brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌的协同抑菌机理，以期为抗菌肽brevilaterin与柠檬酸在食品中的应用提供理论依据。

1、brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌的时间-杀菌曲线

将生长至对数期的大肠杆菌悬液与不同抑菌剂组混合，使菌悬液终浓度为5×CFU/mL，brevilaterin终浓度分别为AU/mL（最小抑菌浓度（MIC））、40AU/mL（1/4MIC），柠檬酸终质量浓度分别为1.25mg/mL（MIC）、0.mg/mL（1/4MIC），联用组brevilaterin（1/4MIC）＋柠檬酸（1/4MIC），以质量分数0.85%生理盐水作为空白对照。将各处理组置于37℃孵育一定时间后，取出涂布平板并于37℃培养18h后进行活菌菌落计数。

brevilaterin、柠檬酸的MIC组和联用组brevilaterin（1/4MIC）＋柠檬酸（1/4MIC）在24h内均呈现抑菌效果，且联用组较brevilaterin（1/4MIC）与柠檬酸（1/4MIC）单独使用的菌落数有明显下降，结果证实brevilaterin（1/4MIC）与柠檬酸（1/4MIC）联用具有协同抑菌效果。

2、brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌细胞跨膜电势的影响

阴性对照组（Nig）、空白对照组荧光强度无明显变化，而阳性对照组（Val）可有效提高钾离子的扩散速率，从而消散膜电位，使荧光强度增加。brevilaterin（1/4MIC）组荧光强度无明显变化，brevilaterin（MIC）组荧光强度明显增加（从增加至左右），说明其会消散膜电位。1/4MIC柠檬酸和MIC柠檬酸组荧光强度均增加，但两者无显著差异，表明1/4MIC和MIC柠檬酸均可以导致细胞膜电势消散，且1/4MIC和MIC柠檬酸对细胞膜电势的消散程度无显著差异。联用组brevilaterin（1/4MIC）＋柠檬酸（1/4MIC）的荧光强度随时间的延长不断增强，其荧光强度明显高于brevilaterin（MIC）组与柠檬酸（MIC）组的荧光强度。

3、brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌细胞膜完整性的影响

空白对照组膜受损率为3.3%，brevilaterin（1/4MIC）组的膜受损率达到了66.7%，brevilaterin（MIC）组的膜受损率较高，为98.1%；柠檬酸（1/4MIC）组的膜受损率20.7%，柠檬酸（MIC）组的膜受损率为60.0%，联合使用组的膜受损率高达99.5%。因此，上述结果表明brevilaterin（MIC）基本能够破坏全部细胞的膜完整性，柠檬酸（MIC）仅能破坏部分细胞的膜完整性，联用组的膜受损率高于二者单独作用，说明brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌的膜完整性具有协同破坏作用。

未经抑菌剂处理的对照组细胞仅被SYTO9染色，发出绿色荧光，表明细胞膜完整，而经过brevilaterin（1/4MIC）组处理后，60%以上细胞发出红色荧光；经过brevilaterin（MIC）组处理后，几乎所有细胞都发出橙红色荧光。经过柠檬酸（1/4MIC）组处理后，大多数细胞为绿色，而经过柠檬酸（MIC）组处理后，50%以上的细胞呈现红色，表明柠檬酸处理后的细胞膜受损率较brevilaterin（MIC）组小。而联用组brevilaterin（1/4MIC）＋柠檬酸（1/4MIC）细胞几乎全部发出橙红色荧光，说明几乎所有的细胞膜完整性受到破坏，上述结果与流式细胞仪检测结果一致。

4、brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌超微结构的影响

空白对照组菌体形态完好、内容物完整；brevilaterin（MIC）组的细胞发生形变、质壁分离、细胞内容物泄漏等变化；柠檬酸（MIC）组细胞膜边缘模糊且细胞内容物泄漏，表明brevilaterin和柠檬酸均可以破坏细胞的超微结构。此外，brevilaterin（1/4MIC）组部分细胞受损（与时间-杀菌曲线显示的部分抑菌效果一致），细胞内局部出现空腔，柠檬酸（1/4MIC）组无显著影响，但联用组brevilaterin（1/4MIC）＋柠檬酸（1/4MIC）处理后细胞发生形变，菌体内出现空洞，表明brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌超微结构有协同破坏效应。

5、brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌蛋白质合成的影响

brevilaterin（MIC）组（泳道6）在分子质量31kDa附近有一个条带颜色加深（箭头处），其他条带均无明显变化，可能是由于高浓度的brevilaterin促进了此分子质量蛋白质的合成。上述结果表明brevilaterin、柠檬酸对蛋白质表达无显著影响。

6、brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌DNA的影响

空白对照组的DNA条带亮度最强，brevilaterin（1/4MIC）和brevilaterin（MIC）组条带亮度与对照组相比轻微减弱；柠檬酸（1/4MIC）组DNA条带亮度明显降低，柠檬酸（MIC）处理组的DNA条带弥散消失；联用组的DNA条带亮度较brevilaterin（1/4MIC）、柠檬酸（1/4MIC）显著降低。结果表明，柠檬酸对大肠杆菌菌体DNA具有较强的降解作用，brevilaterin和柠檬酸联用组对DNA具有协同降解作用。

讨论

brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌具有协同抑菌作用，可以通过消散细胞跨膜电势，破坏细胞膜完整性，造成菌体DNA降解和细胞内容物泄漏。本研究为brevilaterin与柠檬酸复配组合在食品防腐中的应用中提供了理论参考。

本文《抗菌肽brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌的协同抑菌机理》来源于《食品科学》年41卷19期31-37页，作者：宁亚维，苏丹，付浴男，刘杨柳，王志新，贾英民。DOI:10./spkx---。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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